所谓“退火（Annealing）”，是指将材料暴露于高温环境中持续一段时间，再缓慢冷却到低温的热处理步骤。
对于Oligo来讲，退火过程的主要目的是用于形成DNA的高级结构，如茎环、发夹、双链或其他结构。
1. 溶解oligo
拿到oligo干粉产品之后，对管子进行瞬时离心，加入退火缓冲液进行溶解。
推荐溶解成比较高的浓度，建议100 μM以上浓度。如oligo因浓度较高而不溶解，可以加热并搅拌促溶。
2. 浓度测定&混合
精确测定每个Oligo溶液的浓度，并按照需要的比例进行混合（如等摩尔混合）。如果两条oligo退火形成双链，摩尔数不同会导致多余的单链残留。单链发夹或茎环的退火可跳过此步骤。
3. 退火
将混合体系加热至94°C，持续2 min，然后缓慢降温（一般情况下将至室温即可）。缓慢降温对形成正确的结构是非常有帮助的，降温过快将导致错误高级结构的产生，推荐的方法是将混合管放入一杯94°C的水中，让其自然降至室温。
4. 稀释&储存
降温之后，可以用退火缓冲液稀释至需要的浓度并储存于-20°（长期）或4°C（短期内频繁使用）。
退火缓冲液的配制
退火缓冲液配方：10 mM Tris, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA
其中：tris起到pH缓冲作用，EDTA起到防止oligo降解的作用，盐离子对于DNA双链的形成是必要的。
配制退火缓冲液，需要高温灭菌，并使其中的脱氧核糖核酸酶失活，如果用于siRNA退火，需要保证RNase-free.
适用性
该方法适用于常规oligo、2-甲氧基修饰、锁核酸等高级修饰的oligo以及短链RNA的退火。
退火效率检测
可以通过非变性PAGE胶对变性前的单链oligo以及变性之后的双链oligo同时进行电泳，判断是否退火成功，通常情况下，链长较短时，相同长度的单链比双链DNA的迁移速度要快。但长链oligo由于其本身容易形成高级结构，不推荐进行非变性电泳。