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测序结果说明

正常
菌(质粒)无信号
菌(质粒)重叠峰
PCR无信号
PCR重叠峰
缺失突变
poly结构
高GC
甲基化序列
发夹结构
信号弱

正常

正常测序峰图说明	一个测序反应只能测到1000bp左右。有效碱基(99%准确)在前750bp左右，之后的序列出现宽峰。对于PCR样品，如果一个反应能测通，那么正常的测序结果就能够测到PCR终止末端的那个A碱基。(示意图是1000bp的PCR片段，高保真酶扩增的产物没有末端那个A)。对于菌样或者质粒样品，由于质粒是环状的，序列在正常情况下，都不会出现终止。
	测序的荧光信号，是从测序引物之后的第一个碱基开始。所以测序得到的序列，是看不到测序引物的。PCR样品如果测通了，仅能看到另一端引物的反向互补序列。
	测序信号是荧光信号，请不要送任何干扰我们荧光信号的样品或引物。尤其是荧光定量PCR产物。如果该产物进行常规测序。我们均会正常收费。
	所有的序列文件，都是根据测序峰图导出的。测序结果的好坏，请根据峰图判断。

菌(质粒)无信号

测序峰图说明	序列峰图杂乱无章，测序干扰较大，没有明显主峰。(示意图只提供300bp参考)
测序原因说明	测序模板与引物无法配对，或者配对能力较差，造成测序信号弱甚至无信号。
菌样无信号说明	菌液浓度太低甚至失活，或者载体为低拷贝，造成提取的质粒浓度低，测序无法产生足够信号。
	载体的信息错误，或者载体经过改造，测序引物与模板无法有效结合，造成测序无信号。
	自己附带引物，请根据测序反应的多少，保证足量引物，且每次附带新引物，确保引物没有降解。引物10ul起送。
解决方法	请提供足够浓度的新鲜菌液1mL。
	请正确提供载体信息，非常见载体，请提供载体序列及酶切位点。非常见载体，我们公司可能没有通用引物，或者引物序列不一致，客户可以提供引物序列。
	若双向测序，有一端结果正常，另外一端测序结果无信号，可以考虑单向测通。大部分这样的结果，我们都已针对测序失败的引物，重新测序过。
质粒无信号说明	客户自己提供的质粒浓度太低，造成测序结果信号弱，甚至无信号。实际上多数质粒测序失败，都是客户提供的质粒质量不高造成。
	载体的信息错误，或者载体经过改造，测序引物与模板无法有效结合，造成测序无信号。
	自己附带引物，请根据测序反应的多少，保证足量引物，且每次附带新引物，确保引物没有降解。引物10ul起送。
解决方法	自己提供质粒，样品浓度请大于200ng/ul，低拷贝质粒浓度要求更高。
	请正确提供载体信息，非常见载体，请提供载体序列及酶切位点。非常见载体，我们公司可能没有通用引物，或者引物序列不一致，客户可以提供引物序列。
	若双向测序，有一端结果正常，另外一端测序结果无信号，可以考虑单向测通。大部分这样的结果，我们都已针对测序失败的引物，重新测序过。
典型案例说明	PET系列全部都是低拷贝质粒，测序容易出现信号弱，甚至无信号的情况。
	空载体，如果使用插入片断的序列作为测序引物，测序结果必然出现无信号的情况。

菌(质粒)重叠峰

测序峰图说明	序列峰图从第一个碱基开始一直到测序结束(有时候是很长一部分重叠，不是全部)，测序峰都不是单一峰型，我们称之重叠峰。有些公司称之套峰。
测序原因说明	出现重叠峰，说明上机的模板不止一个。也就是我们测序反应完成之后，产生了不止一个模板。简单的说，就是产生了不止一条序列。
菌样重叠峰说明	接菌可能污染了。这个接菌污染，很有可能是客户挑单克隆的时候污染了，尤其是抗性未加。并非我们扩大培养的时候造成的污染。
	测序引物和模板不止一个结合位点。通用引物并非只能和载体结合，如果插入片段上有位点，哪怕不是100%结合，也有可能出现重叠峰。
	测序引物降解，尤其是客户自带引物容易发生降解。
解决方法	重新挑取单克隆。如果样品本身不存在问题，可能是引物和模板不止一个结合位点。请尝试另外的引物进行测序。
质粒重叠峰说明	客户提取质粒过程中，样品受到污染，造成DNA不止一套。
	测序引物和模板不止一个结合位点。通用引物并非只能和载体结合，如果插入片段上有位点，哪怕不是100%结合，也有可能出现重叠峰。
	测序引物降解，尤其是客户自带引物容易发生降解。
解决方法	重新挑取单克隆。如果样品本身不存在问题，可能是引物和模板不止一个结合位点。请尝试另外的引物进行测序。
典型案例说明	PETDUET系列载体有两个多克隆位点，T7也就有两个结合位点了。T7测序肯定重叠峰。
典型案例说明	非单克隆样品，也是典型的重叠峰型。非单克隆样品，测序结果仅载体部分不是重叠峰。

PCR无信号

测序峰图说明	序列峰图杂乱无章，测序干扰较大，没有明显主峰。(示意图的PCR片段只有280bp)
测序原因说明	测序模板与引物无法配对，或者配对能力较差，造成测序信号弱甚至无信号。
PCR未纯化样品测序无信号说明	样品浓度太低，造成纯化之后的模板浓度太低，测序无法产生足够信号。
	PCR产物送样量太少。造成DNA总量太少，纯化之后无法产生足够模板，测序信号弱，甚至无信号。以上两点是PCR失败的最主要原因。
	PCR片段大于2000bp时，纯化效率显著降低，造成模板浓度不足，测序信号偏弱。
	测序引物与模板没有结合位点。
	测序引物或者模板，已经发生降解。
解决方法	请务必提供30uL以上PCR未纯化产物。若自行检测样品，最多取3uL，检测到明亮清晰的条带为准。
	过长的PCR片段，不建议直接测序。请分段扩增，且片段控制在1000bp左右。
	请每次附带新引物。引物由于稀释到工作浓度，极易发生降解。长期测序的客户，请尽量每个星期都能重新送一些引物。引物10uL起送。
PCR已纯化样品测序无信号说明	样品浓度太低，测序无法产生足够信号。
	测序引物与模板没有结合位点。
	测序引物或者模板，已经发生降解。
解决方法	自行检测样品，最多取3uL，检测到比较清晰的条带为准。由于存在运输上的不确定因素，实际检测效果，以我们公司电泳检测为准。
解决方法	请每次附带新引物。引物10uL起送。
典型案例说明	由于每个客户的PCR效果都不一样，PCR的测序成功率是几种样品类型中最低的。如果PCR测序效果始终不理想，请考虑TA克隆之后再进行测序。

PCR重叠峰

测序峰图说明	序列峰图从第一个碱基开始一直到测序结束(有时候是一部分重叠，不是全部)，测序峰都不是单一峰型，我们称之重叠峰。(示意图的PCR片段只有350bp)
测序原因说明	出现重叠峰，说明上机的模板不止一个。也就是我们测序反应完成之后，产生了不止一个模板。简单的说，就是产生了不止一条序列。
PCR未纯化样品测序重叠峰说明	电泳检测为单一条带，但PCR产物实际不是纯合产物。
	片段差异小于100bp，无法通过琼脂糖胶切胶分离。甚至检测不到非特异性。
	上下游引物混合到同一管进行测序。
	PCR引物与模板有多个结合位点。
	PCR引物已发生降解。
	PCR产物为单引物扩增产物。
解决方法	PCR重叠峰，说明切胶无法分离条带。请根据实验目的，考虑TA克隆之后，再进行测序。
PCR已纯化样品测序重叠峰说明	PCR产物为混合物，纯化并没有分离各条带。
	上下游引物混合到同一管进行测序。
	PCR引物与模板有多个结合位点。
	PCR引物已发生降解。
	PCR产物为单引物扩增产物。
解决方法	尝试送PCR未纯化样品，我们帮您纯化。或者考虑TA克隆之后，再进行测序。
典型案例说明	几乎所有的DGGE胶，都无法分离纯合条带。测序结果基本都是重叠峰。
	16srDNA样品，尤其是27F方向，由于样品存在突变。测序结果出现重叠峰。且样品切胶无法分离条带。
	点突变属于重叠峰范畴。

缺失突变---成功

缺失突变说明	PCR产物测序时常见的二级结构。菌液、质粒一般不存在，因为挑取单克隆已经去除杂合体。缺失突变样品均无法测通、拼接。
测序峰图说明	序列峰图从某一个位点之后出现重叠峰。峰图末端出现不止一个代表PCR终止的‘A峰’。
测序原因说明	DNA模板并非纯合体,或者DNA是混合物。扩增产物出现长度多态性，且切胶无法分离条带。缺失的序列以及长度，我们都无法准确得知。
解决方法	缺失突变属于重叠峰范畴。请将PCR产物TA克隆之后，挑取不止一个单菌落进行测序。
解决方法	从反向测序，仅仅会得到长度互补的位点之后出现重叠峰。

poly结构---成功

poly结构说明	各种样品类型均会出现的常见二级结构。测通的样品，无法通过单向测通这样的序列。双向测序有可能测通全长并拼接。
测序峰图说明	序列峰图出现连续单个碱基重复，造成该结构之后的序列出现重叠峰，甚至反应中断。尤其polyG、polyC，会造成测序反应中断。
测序原因说明	poly结构会造成碱基的滑动错配，导致重叠峰。
解决方法	poly结构虽然属于重叠峰范畴，但是无法通过分离单克隆来进行测通。只能尝试从反方向测到该结构，然后两个方向的序列尝试进行拼接。

高GC---成功

高GC说明	各种样品类型均会出现的常见二级结构。
测序峰图说明	序列GC含量太高。
测序原因说明	序列GC含量太高，有可能产生回文结构。造成测序反应后弱，严重的情况造成测序反应无法有效延伸，序列中断。
解决方法	两个方向均可以尝试进行测序，但是我们无法保证一定能测通。

甲基化序列---成功

甲基化序列说明	近年来流行的二级结构。尤其是针对线粒体的序列。
测序峰图说明	一条序列GT碱基含量很高，互补的序列是AC含量高。GT含量高的这个方向90%会反应中断。
测序原因说明	该序列能引起DNA的二级结构，造成测序无法正常延伸，测序反应中断。
解决方法	从AC含量高的方向测序，也就是测示意图的互补链，基本上100%能测通这个结构。但是TA克隆的客户请注意，由于TA克隆的不定向性，我们无法保证一个方向就能测通。做线粒体的客户请注意，线粒体DNA存在高度甲基化，PCR引物有可能特异性很差，且不是每个方向都适合进行测序。
解决方法

发夹结构---成功

发夹结构说明	非常常见的二级结构。
测序峰图说明	序列峰图从某一个位点之后突然(或逐渐)出现信号减弱、重叠峰、无信号峰型、反应终止。
测序原因说明	该峰型，我们无法准确告知是哪段序列造成的何种二级结构。但是测序反应由于非正常情况，造成的延伸障碍，使得序列后半部分峰型发生巨大改变。我们都会规定在这种特殊结构之中。
解决方法	发夹结构的样品，我们均会按比高GC更高一级的标准尝试测序，有可能无法单向测通。但是也无法保证从另一个方向能测通这个结构。互补的那个序列有可能存在更严重的结构，也有可能和甲基化序列一样，能轻松通过。

信号弱

信号弱	介于正常和无信号之间的结果。
测序峰图说明	测序结果在无信号和正常结果之间，有主峰，但是噪音干扰很大(并非重叠峰型)，测序信号弱，或者提前中断。
测序原因说明	测序并不是只出现正常结果，以及测序无信号的结果。很多测序结果由于样品浓度太低，测序反应无法正常延伸，序列信号提前减弱，达不到正常结果的标准，我们按信号弱处理。并不一定是测序技术的问题，有可能是样品本身不太理想。长时间的运输、温度，都有可能使样品发生降解，造成浓度降低。
解决方法	信号弱的样品，建议重新制备符合要求的样品。若客户要求重新测序，如果重新测序对该结果没有产生任何改善，我们也将对重新测序的结果收费费用。感谢您的理解和支持。