技术 | qPCR不正常曲线分析
溶解曲线主峰左侧有峰
一般考虑是引物二聚体或者短的非特异性扩增，解决手段通常有：
◆ 降低引物浓度
20ul体系正常参考引物用量是10uM浓度 0.4ul
◆ 提高退火温度
梯度摸索引物退火温度，一般退火温度不建议超过63°C
◆ 增加模板浓度
当目的基因表达量极低时，染料法QPCR容易形成引物二聚体产物影响实验结果，提高模板浓度
◆ 重新设计引物
溶解曲线主峰右侧有峰
一般考虑非特异性扩增，去除非特异性扩增的手段有：
◆ 提高退火温度:
梯度摸索引物退火温度，一般退火温度不建议超过63°C
◆ 提取的RNA需要去除基因组DNA污染，或者
◆ 重新设计引物
ROX添加不当
ROX矫正不当可能形成如下熔解曲线图
解决手段通常有：
◆ 一定要清楚机器的ROX矫正信息，加的时候一定要看清标签，高低要分清
◆ ROX要完全融化，混合均匀后再使用
◆ 如果是需要矫正的机器型号但是用了不校正的染料，那么可以关闭软件里面的ROX矫正选项，重新分析数据
高浓度抑制
◆ 高浓度模板可能存在一些抑制因素，导致扩增产物的减少，稀释后抑制就降低或者解除了
◆ 所以如果出现这样的情况可以调整模板浓度，Ct滞后我们也可以调整下稀释倍数，保证足够多的标准点。
浓度梯度Ct值异常
◆ 前面不能出现梯度，原因可能是模板量过高，超出了线性范围，那么需要去掉前面不能分开的梯度，选择后面梯度；
◆ 后面不能出现梯度，原因可能是模板量低，超出了线性范围，那么需要去掉后面这些梯度，重新摸索高浓度梯度。
无扩增曲线
◆ 机器设定：首先要看下程序的设定方面，如果程序设定错误，那么是采集不到荧光信号的，
（两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72°延伸阶段）
◆ 循环数：循环数不够，一般要设置40个循环，但是循环数太多的话会增加背景信号，降低数据的可信度；
◆ 引物降解：可以通过变性PAGE检测引物是否降解
◆ 引物不合适：重新设计引物
◆ 模板浓度太低： 减少模板稀释倍数，如果是未知浓度样品建议从高浓度开始预实验；
◆ 模板降解：重新制备模板，重复实验
◆ 表达量低：重新反复设计引物，4-5对不可以放弃该基因
Ct值偏大
◆ 引物不够好，扩增效率低，重新设计引物或探针；
◆ 优化PCR条件：
- 改用三步法；
- 增加镁离子浓度（如果用mix应该也调整不了这个浓度）
- PCR各反应成分的降解或加样量不足
- 扩增片段太长：建议长度80-200bp
◆ 基因表达量低：
若重新反复设计引物仍不能解决问题，可以放弃该基因或使用其他更为灵敏的检测方法
扩增曲线先下降后上升
◆ 模板浓度太高,基线的终点值大于CT值：
手动设置减小基线终点值,重新分析数据，(默认的基线范围一般是3~15个循环,如果遇到扩增在10个循环就起来的那么收到把基线范围设置到3~5就可以了,或者是CT值前4~5个循环，基线的设置很可能会影响到引物的扩增效率的结果)
没有对数增长期
◆ 探针部分降解导致的，如反复冻融探针；在光下暴露时间过长都可能引起，需要重新更换引物探针
◆ PCR反应液中有PCR抑制物，如模板浓度过高，模板中有杂质等
某一空的荧光信号 特别强
◆ 试剂制备时没有充分混匀，各管成分不一样
◆ 如果是探针法的话，可能是探针没有融化，有一管中的探针量太多
◆ 也可能是机器原因，不过这个可能性不大
扩增曲线有向上的尖峰
◆ 可能是电压不稳定导致的，也可能是断电或者突然开盖导致的。
山峰形扩增曲线
◆ 反应液蒸发，可能管子没有盖好或者管子质量差
标曲标准偏差大于0.5
扩增反应的对数线性期的斜率可用于检测反应效率。
● 良好的反应效率应在90%-110%之间。
● 扩增效率低于100%，是因为PCR扩增体系中的抑制因素 ,或者RNA有所降解；
● 高于100%是因为非特异性扩增或引物二聚体造成。
解决方案：
◆ 试剂使用前需要彻底融化充分混匀，包括Mix、引物和探针
◆ 使用精确的移液器，加样时候要垂直加样
● 扩增信号太弱
● 仪器本身的问题，可能在扩增过程中仪器出现了波动